"Методические указания по определению трифумина и его метаболитов в овощах, фруктах, зерне, почве и воде методом тонкослойной хроматографии"

Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1989 г. N 5026-89

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ТРИФУМИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В ОВОЩАХ,

ФРУКТАХ, ЗЕРНЕ, ПОЧВЕ И ВОДЕ МЕТОДОМ

ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

--------------------------------

<*> Разработаны М.В. Письменной, М.А. Клисенко (ВНИИГИНТОКС).

Краткая характеристика препарата и его основных метаболитов. Трифумин

(NF-114, трифмин), действующее начало 4-хлор-альфа, альфа, альфа-трифтор-

N-1(III-имидазол-1-ил)-2-пропоксиэтилиден-0-толуидин. Брутто - формула

C H ClF N O. Молекулярная масса 345,75. Общепринятое название -

15 15 3 3

трифлумизол. Кристаллический порошок без запаха, т. пл. 63,5 °C,

растворимость (г/100 мл при 25 °C): в воде (pH 5,3) - 0,0015, ацетоне -

261, хлороформе - 185, н-гексане - 4,4, метаноле - 50; давление паров 1,9 x

-4

10 Па (25 °C). В водных растворах наиболее устойчив при pH 6. С

увеличением температуры гидролиз значительно ускоряется. Временные МДУ в

огурцах, томатах, яблоках 0,1 мг/кг. Содержание трифумина в винограде и

землянике не допускается.

Основные метаболиты трифумина: 1-(4-хлор-1-трифторметилфенил)-2-

пропоксиамидин, (ТМ-6-1). Белые кристаллы без запаха, растворимы в

метаноле, н-гексане, дихлорметане. Брутто - формула C H ClF N O.

12 14 3 2

Молекулярная масса 294,6. N-(4-хлор-2-трифторметилфенил)-1-

пропоксиацетамид, (ФД-1-1) - бесцветная маслянистая жидкость, растворима в

метаноле, н-гексане, дихлорметане. Брутто - формула C H ClF NO .

12 13 3 2

Молекулярная масса 295,7.

Принцип метода. Метод основан на экстракции трифумина и его метаболитов

из пробы органическим растворителем, концентрировании, очистке на слое

Al O после перераспределения веществ в смесь этанол - 0,02 н HCl (1:1),

2 3

последующем подщелачивании раствора до pH 7,5 и экстракции их в н-гексан.

Тонкослойнохроматографическое определение проводят в тонком слое пластинок

"Алуфол" или "Силуфол", используя в качестве проявляющего реагента 1-нафтол

после термического разложения веществ на пластинке до ароматического амина

и диазотирования, либо реагент на основе бромфенолового синего с AgNO .

Первый вариант проявления позволяет обнаружить трифумин и его метаболиты,

второй - только трифумин.

Метрологическая характеристика метода. Нижний предел обнаружения по реакции азосочетания 0,2 мкг (на пластинках "Алуфол"), 3 мкг (на пластинках "Силуфол"); по реакции с бромфеноловым синим 1 мкг (на пластинках "Силуфол"). Метрологические характеристики определения трифумина в воде, почве, овощах, фруктах и зерне приведены в таблице 141.

Таблица 141

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА

┌────────┬──────────┬─────────────┬────────────┬─────────────┬────────────┐

│Опреде- │Иссле- │Нижний предел│ Среднее │Доверительный│ Число │

│ляемое │дуемый │определения, │ значение │ интервал │параллельных│

│вещество│объект │ мг/кг или │определения,│среднего при │определений,│

│ │ │ мг/л <*> │ % │ p = 0,95, % │ n │

├────────┼──────────┼─────────────┼────────────┼─────────────┼────────────┤

│Трифумин│Вода │0,001 <**> │86 │+/- 8,4 │7 │

│ │Овощи, │0,004 │92 │+/- 2,9 │30 │

│ │фрукты │ │ │ │ │

│ │Зерно │0,008 │91 │+/- 10,4 │7 │

│ │Почва │0,004 │91 │+/- 8,9 │7 │

│ФМ-6-1 │Вода │0,001 <**> │92 │+/- 7,9 │8 │

│ │Овощи, │0,004 │95 │+/- 2,1 │30 │

│ │фрукты │ │ │ │ │

│ │Зерно │0,008 │90 │+/- 8,7 │7 │

│ │Почва │0,004 │96 │+/- 4,2 │7 │

│ФД-1-1 │Вода │0,001 <**> │85 │+/- 9,1 │8 │

│ │Овощи, │0,004 │92 │+/- 2,5 │30 │

│ │фрукты │ │ │ │ │

│ │Зерно │0,008 │88 │+/- 10,8 │7 │

│ │Почва │0,004 │87 │+/- 9,0 │7 │

└────────┴──────────┴─────────────┴────────────┴─────────────┴────────────┘

--------------------------------

<*> Приведены данные при обнаружении по реакции азосочетания на пластинках "Алуфол".

<**> Предел определения в воде можно снизить в 2,5 раза (до 0,0004 мг/л), увеличив объем пробы, взятой для анализа, до 500 мл.

Избирательность метода. Применение двух проявляющих реагентов, позволяющих обнаруживать трифумин по различным функциональным группам, дает возможность идентифицировать его в присутствии хлор-, фосфорсодержащих пестицидов, триазинов, производных фенилмочевины.

Реактивы и материалы. Ацетон х.ч. н-Гексан х.ч. Сульфат натрия безводный, ч. Хлороводородная кислота х.ч., концентрированная и 0,01 и 0,02 н водные растворы, приготовленные из фиксанала. Гидроксид натрия х.ч., 0,01 н водный раствор. Гидроксид калия ч. Хлорид натрия ч.д.а. 1-Нафтол ч.д.а. Бромфеноловый синий индикатор ч.д.а. Нитрат серебра ч.д.а. Этанол 96-процентный, стандартные пластинки "Алуфол", "Силуфол" (20 x 20 см), "Хемапол", ЧСФР. Индикаторная бумага универсальная "Реахим" или "Лахема", "Хемапол", ЧСФР. Оксид алюминия для хроматографии. Фильтры легкофильтрующие "красная лента". Препарат трифумин, метаболиты трифумина ФМ-6-1 и ФД-1-1. Основные стандартные растворы трифумина и его метаболитов с концентрацией на 1000 мкг/мл готовят растворением 25 мг каждого вещества в 5 мл ацетона. Объем раствора доводят в мерных колбах н-гексаном до 25 мл. Трифумин в растворе устойчив при хранении в течение 1,5 мес., метаболиты - 3 мес. Рабочий стандартный раствор - смесь трифумина и его метаболитов. Вносят 5 мл основного стандартного раствора каждого вещества в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора н-гексаном до метки. Концентрация в смеси каждого вещества 100 мкг/мл. Растворы устойчивы в холодильнике в течение 10 дней. Проявляющие реагенты: N 1 - а - к смеси из 46 мл воды и 4 мл концентрированной хлороводородной кислоты прибавляют 1 г нитрита натрия; б - к раствору 2,8 г гидроксида калия в 50 мл воды прибавляют 0,1 г 1-нафтола. Проявляющие реагенты применяют свежеприготовленными; N 2 - а - 0,05 г бромфенолового синего растворяют в 10 мл ацетона и доводят объем раствора до 100 мл 1-процентным водно-ацетоновым (вода-ацетон 1:3) раствором нитрата серебра; б - 5-процентный водный раствор уксусной кислоты по объему (5 мл уксусной кислоты и 95 мл воды). Растворы устойчивы в течение 2 мес.

Приборы и посуда. Аппарат для встряхивания. Дробилка почвенная лабораторная или ступка. Ротационный вакуумный испаритель. Колбы мерные вместимостью 25; 50 и 100 мл, конические вместимостью 50; 100 и 250 мл; грушевидные вместимостью 50 и 100 мл ОКШ 50-14/23ТС. Сита почвенные. Воронки химические, делительные на 50; 250 и 500 мл. Пробирки мерные на шлифах вместимостью 5 мл. Пипетки на 0,1; 0,2; 1; 5 и 10 мл.

Подготовка пластинок для хроматографии. Пластинки "Алуфол" или "Силуфол" перед нанесением пробы промывают в хроматографической камере ацетоном, давая растворителю подняться до верхнего края пластинки. Отмечают верхний край пластинки, дают растворителю испариться с пластинки и прогревают ее 20 мин. при 60 °C. При хроматографировании линия старта должна быть со стороны нижнего края пластинки.

Ход анализа. Экстракция. К 200 мл воды прибавляют 5 г NaCl, перемешивают, прибавляют 50 мл ацетона, а затем переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют н-гексаном порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз в течение 3 мин. Верхний органический слой сливают в колбу для отгонки, фильтруя через слой безводного сульфата натрия (10 - 15 г), насыпанного на легкофильтрующий фильтр "красная лента", вложенный в фильтровальную воронку. Упаривают растворитель до 0,5 мл под вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более 45 °C (в фарфоровых чашках при комнатной температуре). Остаток упаривают до 0,2 - 0,3 мл при комнатной температуре и хроматографируют. Пробу количественно наносят на пластинку, ополаскивая колбу н-гексаном (3 - 4 раза по ~ 0,1 мл).

К 50 г почвы, измельченной до 0,5 - 1 см, овощей, фруктов, к 25 г измельченного до 2 - 3 мм и отсеянного от муки зерна прибавляют 60 мл (к зерну - 40 мл) смеси н-гексан-ацетон (7:3) и экстрагируют в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания. Экстракт сливают в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через слой безводного сульфата натрия (10 г) на фильтровальной воронке с небольшим ватным тампоном. Приливают к пробе новую порцию смеси растворителей, повторяют экстракцию. Экстракты объединяют, сливая через слой безводного сульфата натрия. Если экстракт мутный, добавляют в него безводный сульфат натрия (10 - 15 г), а затем фильтруют через небольшой ватный тампон. Упаривают экстракт до 0,5 мл под вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более 45 °C. Остаток упаривают досуха при комнатной температуре и очищают от сопутствующих веществ.

Очистка от сопутствующих веществ. Оксид алюминия 2 куб. см (2,5 г) насыпают на легкофильтрующий фильтр "красная лента", вложенный в небольшую фильтровальную воронку, промывают 10 мл 0,01 н HCl, элюат отбрасывают. К сухому остатку в колбе прибавляют 4 мл смеси этанол - 0,02 н HCl (1:1), ополаскивают этим раствором колбу и фильтруют его через подготовленный слой оксида алюминия. Колбу несколько раз ополаскивают 0,01 н HCl (общий объем 10 мл), сливая каждый раз смывы через слой оксида алюминия. Оксид алюминия промывают 5 мл воды и присоединяют к фильтрату. К полученному фильтрату прибавляют 50 мл воды, нейтрализуют раствор 0,01 н NaOH и доводят до pH 7,5 (контроль по индикаторной бумаге). Полученный раствор переносят в делительную воронку и 4 раза экстрагируют н-гексаном, предварительно насыщенным водой, порциями по 20 мл. Объединенные н-гексановые экстракты промывают 20 мл воды, воду отбрасывают, н-гексан сушат, сливая через слой безводного сульфата натрия на воронке. К экстракту прибавляют 20 мл ацетона и упаривают до 0,5 мл под вакуумом, как описано выше для воды.

Условия хроматографирования при методе ТСХ. На пластинку "Алуфол",

промытую ацетоном, с помощью капилляра или микропипетки наносят пробу,

ополаскивая колбу 3 - 4 раза небольшими количествами (0,1 мл) н-гексана. На

эту же пластинку наносят 0,05 - 0,2 мл рабочего стандартного раствора смеси

трифумина и его метаболитов. Пластинку хроматографируют в подвижной фазе

гексан-ацетон (3:1) при температуре в помещении 20 - 22 °C или

гексан-ацетон (4:1) при температуре выше 22 °C. После того как фронт

растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры, отмечают

линию фронта и оставляют на несколько минут на воздухе до испарения

растворителя. Затем пластинку слегка опрыскивают 0,01 н раствором HCl и

прогревают в сушильном шкафу при температуре 160 - 170 °C в течение 1 ч.

После охлаждения ее помещают в камеру для опрыскивания и орошают

проявляющим реагентом N 1 - сначала реактивом а и сразу же реактивом б.

Трифумин и его метаболиты проявляются в виде красных пятен. Величина R

трифумина, ФМ-6-1, ФД-1-1 и подвижной фазе гексан-ацетон (3:1)

соответственно 0,23; 0,49; 0,82; в ПФ гексан-ацетон (4:1) - соответственно

0,17; 0,37; 0,78. Для этой реакции можно также использовать пластинки

"Силуфол", но чувствительность обнаружения будет ниже.

При использовании проявляющего реагента на основе бромфенолового синего

(реагент N 2) пробу наносят на пластинку "Силуфол", хроматографируют в ПФ

гексан-ацетон (2:1). При проявлении орошают сначала реактивом N 2 а,

прогревают при 100 °C в течение 5 мин. и орошают реактивом N 2 б. Трифумин

проявляется в виде синего пятна на желтом фоне. Величина R 0,35;

метаболиты ФМ-6-1 и ФД-1-1 в малых концентрациях (до 10 мкг) не

обнаруживаются, при больших концентрациях они могут проступать в виде более

светлых, чем фон, пятен. Величина R ФМ-6-1 и ФД-1-1 соответственно равна

0,61 и 0,93.

Обработка результатов анализа. Количественное определение трифумина и его метаболитов проводят путем сравнения интенсивности окраски и размера пятен проб с пятнами стандартных растворов на одной пластинке. Прямо пропорциональная зависимость площади пятен от концентрации препаратов (при одинаковом диаметре пятна, нанесенного на старте) наблюдается в пределах 0,2 - 5 мкг (пластинки "Алуфол", проявляющий реагент N 1); 1 - 20 мкг (пластинки "Силуфол", проявляющий реагент N 2). При больших концентрациях следует анализировать аликвотную часть экстракта параллельной пробы.

Концентрацию трифумина и его метаболитов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = -,

где:

A - количество трифумина (или метаболита), найденное в хроматографируемой пробе, мкг;

P - навеска анализируемой пробы, г.

Требования безопасности. Соблюдать требования безопасности, принятые для работы с пестицидами и легковоспламеняющимися жидкостями.