"Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом"

Утверждены

Минздравом СССР

22 мая 1985 г. N 3891-85

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕПИДОЦИДА НА ОБРАБОТАННЫХ ИМ РАСТЕНИЯХ

ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

Краткая характеристика препарата. Лепидоцид - бактериальный

инсектицидный препарат для борьбы с листогрызущими насекомыми.

Действующим началом препарата служат споры и продукты

жизнедеятельности бактерий Bacillus thuringiensis Var. kurstaki.

Он практически не токсичен для теплокровных животных: при введении

в желудок ЛД для белых мышей превышает 15 г/кг, для белых крыс -

9,7 +/- 1,9 г/кг. Споры в организме теплокровных не прорастают и

не вызывают инфекционного заболевания. Препарат представляет собой

аморфный порошок кремового цвета со слабым специфическим запахом.

В воде образует нестойкую суспензию.

Принцип метода. В основу определения остаточных количеств лепидоцида на растениях положены реакция взаимодействия антигена из спор микроорганизма с меченными флюоресцеином антителами и выявление спор в люминесцентном микроскопе по специфическому свечению. Использован непрямой иммунофлюоресцентный метод.

Метрологическая характеристика метода. Предел обнаружения:

одна спора в 50 полях зрения, что соответствует (при титре

11 3

лепидоцида 10 спор/г) 0,01 мкг препарата на 1 г пробы, или 10

спор на 1 г пробы. Ошибка метода 15%.

Избирательность метода. Метод специфичен при условии использования иммунных сывороток против спор микроорганизма, активных в разведениях 1:160 - 1:640 и выше.

Реактивы и материалы. Этанол х.ч. Хлорид натрия, 0,85-процентный раствор. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Сухая люминесцентная ослиная сыворотка против глобулинов кролика производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва. Специфическая иммунная сыворотка кролика против спор.

Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп марки

МБИ-15 или другой аналогичный. Объект-микрометр. Центрифуга с

-1

частотой вращения 12 мин. . Термостат на 37 °C. Аппарат для

встряхивания. Колбы. Пробирки бактериологические. Чашки Петри.

Предметные стекла. Микропипетки.

Подготовка к анализу. Приготовление специфических сывороток

против спор Bacillus thuringiensis Var. kurstaki. Для получения

специфической иммунной сыворотки проводят иммунизацию кроликов

однократной инъекцией в область подколенного лимфатического узла

суспензии спор чистой культуры, прогретой в течение 1 ч на кипящей

водяной бане, в дозе 10 микробных клеток на животное. Через месяц

кроликов реиммунизируют второй однократной инъекцией антигена из

спор в область подколенного лимфатического узла в той же дозе.

Спустя месяц после реиммунизации проверяют титр сыворотки в

непрямой реакции иммунофлюоресценции. При титре не менее 1:160

получают сыворотку в нужном количестве и используют для проведения

анализа. Сыворотки консервируют мертиолатом в соотношении 1:10000

или подвергают лиофильному высушиванию.

Определение титра специфической иммунной сыворотки. Из чистой

культуры или из товарной формы препарата готовят взвесь спор в

физиологическом растворе в концентрации 10 спор в 1 мл (из

препарата готовят суспензию в разведении 1:1000).

На обезжиренные сухие предметные стекла наносят по капле взвеси и готовят из нее мазки, равномерно распределяя каплю. После подсушивания на воздухе мазки фиксируют этанолом в течение 30 мин., обрабатывают иммунной сывороткой в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. Далее препараты обрабатывают люминесцирующей ослиной сывороткой против глобулинов кролика, как описано ниже, просматривают в люминесцентном микроскопе и оценивают реакцию по интенсивности свечения оболочки спор.

Для контроля иммунологической специфичности готовят три контрольных препарата: мазок обрабатывают физиологическим раствором вместо иммунной кроличьей сыворотки; нормальной кроличьей сывороткой; только люминесцирующей антивидовой сывороткой.

За титр сыворотки принимают ее максимальное разведение, при котором еще отмечается четкое, "полыхающее" зеленое свечение оболочки спор. В контрольных мазках свечение оболочки спор отсутствует. Для анализа используют сыворотки, имеющие титр не менее 1:160. Рабочим разведением служит разведение, равное 1/2 титра, т.е. 1:80.

Отбор проб. Пробы отбирают в стерильные бумажные пакеты, сохраняют в прохладном месте при температуре не выше 5 °C и анализируют не позднее 5 - 6 дней.

Ход анализа. Для анализа 1 г листьев измельчают с соблюдением

правил асептики, добавляют 15 - 20 мл стерильного физиологического

раствора и встряхивают в колбе на шуттель-аппарате в течение 20

мин. Смыв фильтруют через два слоя стерильной марли и ваты и

-1

центрифугируют 20 мин. при частоте вращения 12 тыс. мин. .

Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в 0,01 мл

физиологического раствора. На предметные стекла наносят 0,01 мл

суспензии и равномерно распределяют ее на площади в 1 кв. см.

Препараты подсушивают на воздухе и фиксируют этанолом 30 мин.

Затем наносят иммунную сыворотку против спор Bacillus

thuringiensis Var. kurstaki в рабочем разведении и помещают во

влажную камеру на 20 мин. при температуре 37 °C. Влажную камеру

создают путем помещения в чашку Петри фильтра, смоченного

физиологическим раствором.

По истечении времени инкубации препараты промывают 1 - 2 мин. проточной водой, высушивают на воздухе, а затем обрабатывают ослиной сывороткой против глобулинов кролика в ее рабочем разведении и оставляют в контакте с ней в течение 20 мин. во влажной камере при 37 °C. Затем препараты промывают водой 1 - 2 мин., высушивают на воздухе и просматривают в люминесцентном микроскопе с иммерсионным объективом 90 x 1,25 и окуляром 4x, используя нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

Одновременно готовят контрольные препараты из взвеси лепидоцида 1:1000 на физиологическом растворе и из проб, взятых на необработанных участках, которые обрабатывают по той же схеме.

Для анализа плодов (например, яблок) исследования проводят следующим образом: целый плод взвешивают, заливают определенным объемом стерильного физиологического раствора, достаточного для полного смачивания. Смыв проводят путем встряхивания сосуда с пробой на шуттель-аппарате в течение 20 мин. Смыв фильтруют, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, ресуспендируют осадок в 0,1 мл физиологического раствора, готовят препарат на предметном стекле и обрабатывают его, как указано выше.

Обработка результатов анализа. С помощью микрометра измеряют площадь поля зрения микроскопа при выбранном для работы увеличении. При использовании объектива 90 x 1,25 и окуляра 4x она равна 0,02 кв. мм.

На каждом мазке под иммерсией просматривают 50 полей зрения, в которых подсчитывают все споры, имеющие яркое, "полыхающее" зеленое свечение. Вычисляют среднее значение количества спор в одном поле зрения. Число спор в 1 кг пробы вычисляют по формуле:

1000aSV

X = -------,

V S M

1 1

где:

a - число спор в одном поле зрения;

S - площадь мазка на предметном стекле, по условиям методики

100 кв. мм;

S - площадь одного поля зрения. При использовании объектива

90 x 1,25 и окуляра 4x она равна 0,02 кв. мм;

V - разведение, равно 0,1, т.к. осадок ресуспендируют в

0,1 мл;

V - объем суспензии, нанесенной на стекло. По условиям

методики он равен 0,01 мл;

M - масса пробы, г;

1000 - коэффициент для пересчета граммов в кг.

С учетом значений известных величин формула упрощается:

100 x 0,1 x 1000 x a 10 x a

X = -------------------- = -------.

0,01 x 0,02 x M 2 x M

Требования безопасности. Соблюдаются общие меры безопасности при работе с химическими реактивами и рекомендуемые для работы с условно-патогенными микроорганизмами: предупреждение загрязнения проб и соблюдение правил личной гигиены.