Утверждены
Минздравом СССР
30 марта 1981 г. N 2366-81
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ФАДЕМОРФА В ВИШНЕ, ОГУРЦАХ, СМОРОДИНЕ,
ЯБЛОКАХ, ВОДЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Краткая характеристика препарата. Фадеморф - N-(1-формиламино-
2,2,2-трихлорэтил)морфолин. Брутто-формула C H O N Cl .
7 6 2 2 3
Молекулярная масса 214,5. Общепринятое название - триморфамид.
Химически чистый препарат - белое кристаллическое вещество с т.
пл. 116 - 117 °C. Растворимость, г/л: вода - 3 (при 10 °C);
толуол - 100 (при 13 °C); этанол - 1200 (при 23 °C); ацетон -
600 (при 15 °C).
ДСД 0,05 <*> мг/кг. МДУ 0,2
<*> (яблоки), 0,1 <*> (виноград), 0,2 <*> мг/кг (огурцы).
--------------------------------
<*> Временный норматив.
Принцип метода. Метод основан на
извлечении триморфамида из анализируемой пробы
органическим растворителем, очистке экстракта в системе жидкость - жидкость и
последующем определении хроматографическими методами.
Метрологическая характеристика метода
дана в таблице 161.
Таблица 161
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА
┌────────────────┬─────────────────┬────────────────┬─────────────────────┐
│ Объект │Среднее значение │ Относительное │ Доверительный │
│ исследования │ определения, % │ стандартное │интервал среднего при│
│ │ │ отклонение, % │ p = 0,95, n = 3, % │
├────────────────┼─────────────────┼────────────────┼─────────────────────┤
│Вода │87 │+/- 2,3 │+/- 3,0 │
│Вишня │74 │+/- 3,1 │+/- 4,7 │
│Яблоки │72 │+/- 3,8 │+/- 5,1 │
└────────────────┴─────────────────┴────────────────┴─────────────────────┘
Примечание. Предел определения: для воды
- 0,005 мг/л; растений - 0,02 мг/кг.
Реактивы и растворы. Для экстракции.
Ацетон х.ч. Хлороформ ч. Хлороводородная
кислота, 10-процентный раствор. Сульфат натрия безводный ч.
Для метода ТСХ. Силикагель для
хроматографии КСК. Сульфат кальция ч.д.а.
Марганцовокислый калий, 3-процентный раствор. Хлорирующий раствор - смесь
равных объемов 2-процентного раствора марганцовокислого калия и 10-процентного
раствора хлороводородной кислоты. Готовить под тягой.
Проявляющий реагент: 0,1 г о-толидина растворяют в
0,5 мл уксусной кислоты; 0,4 г KI растворяют в 5 мл дистиллированной воды.
Растворы объединяют и разбавляют водой до 100 мл.
Для ГЖХ. Неподвижная фаза 5% SE-30 на хроматоне N-AW или любая аналогичная неполярная фаза.
Основной стандартный раствор триморфамида 200 мкг/мл
в ацетоне. Хранят в холодильнике в течение 2 мес. Стандартные растворы триморфамида - 1 и 5 мкг/мл в ацетоне. Хранят в
холодильнике в течение 2 недель.
Приборы и посуда. Ротационный вакуумный
испаритель. Колбы конические на 250 мл. Воронки: химические; делительные.
Пипетки. Цилиндр с делениями. Пластинки стеклянные размером 9 x 12 см.
Микропипетки. Пульверизатор стеклянный. Камера для хроматографирования.
Микрошприцы на 10 мкл.
Хроматограф с ДЭЗ или ДПР. Колонка стеклянная, диаметр 3 мм, длина 1 м. Азот
газообразный особой чистоты.
Ход анализа. Экстракция и очистка
экстрактов. Среднюю пробу овощей и фруктов 25 г (вишня, огурец, смородина и
др.) размалывают и помещают в коническую колбу. Пробу заливают 50 мл смеси
ацетон - вода (1:1), встряхивают в течение 30 мин. Экстракцию повторяют дважды.
Фильтруют раствор в делительную воронку, прибавляют 100 мл дистиллированной
воды, подкисляют водный раствор хлороводородной
кислотой до pH 3 - 3,5 и из водного раствора реэкстрагируют фадеморф
хлороформом дважды порциями по 30 мл. Органический растворитель (хлороформ)
отделяют, сушат безводным сульфатом натрия, упаривают до объема 0,2 - 0,3 мл,
досуха доупаривают на воздухе. Остаток в колбе
растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют (методы
ГЖХ и ТСХ).
Пробу воды (200 мл) помещают в
делительную воронку, подкисляют хлороводородной
кислотой до pH 3 - 3,5 и экстрагируют фадеморф дважды хлороформом порциями по 20 мл. Экстракт
объединяют, сушат безводным сульфатом натрия, упаривают до объема 0,2 - 0,3 мл
досуха на воздухе. Остаток в колбе растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют (методы ГЖХ и ТСХ).
Метод ГЖХ. Носитель - хроматон N-AW (0,16 - 0,20 мм)
силанизированный. Неподвижная фаза - 5% SE-30 (основная). Для
дополнительной идентификации хроматографирование можно проводить
на колонке длиной 1 м с неподвижной фазой 15% карбовакса 20 М.
-12
Скорость азота 70 мл/мин. Шкала электрометра 20 x 10 А.
Линейный диапазон детектирования 0,1 - 4 нг. Температура, °C:
колонки - 170; испарителя - 200; детектора - 200.
При указанных температурных условиях
время удерживания фадеморфа составляет: на фазе SE-30
- 3,3 мин.; на фазе карбовакс 20 М - 6,1 мин.
Вводимый объем 2 - 5 мин.
Обработка результатов анализа при ГЖХ.
Количественное определение проводят путем сравнения рассчитываемого пика с
пиком, полученным при введении известного количества стандартного раствора, при
условии, что пики близки по величине и определение ведется в диапазоне
линейности детектора.
Количественную оценку хроматограммы
проводят по площади пика, рассчитывая ее как произведение высоты пика на
ширину, измеренную на половине высоты.
Количество препарата в пробе (X, мг/кг
или мг/л) определяют по формуле:
C V S
ст 2
X = ------,
S V P
ст 1
где:
C - количество препарата во введенном в хроматограф
ст
стандартном растворе, нг;
S, S - площади пиков соответственно стандартного раствора
ст
фадеморфа, введенного в хроматограф, и исследуемого раствора,
кв. мм;
V - объем экстракта, введенный в хроматограф, мкл;
1
V - общий объем экстракта после упаривания, мл;
2
P - масса или объем анализируемой пробы, г или мл.
Метод ТСХ. Пробу, сконцентрированную до
0,3 мл, с помощью микропипетки количественно переносят на хроматографическую
пластинку, смывая колбу эфиром. На эту же пластинку наносят 3 и 6 мкг фадеморфа. Помещают пластинку в камеру, в которую за 30
мин. до хроматографирования налита смесь гексан - ацетон (1:1). После поднятия фронта растворителя
на 10 см пластинку вынимают, дают испариться растворителю.
Помещают пластинку в эксикатор на 3 - 5 мин., содержащий
хлорирующую смесь, затем высушивают 10 - 15 мин. (для удаления
хлора) при комнатной температуре. После высушивания ее
обрабатывают раствором о-толидина. Фадеморф проявляется на
хроматограмме в виде ярко-синего пятна. Нижний предел обнаружения
1 мкг. Величина R 0,75 +/- 0,05.
f
Содержание препарата в пробе (X, мг/кг или мл/л) определяют по
формуле:
A
X = -,
P
где:
A - количество препарата, найденное путем
сравнения размера и интенсивности пятен пробы и стандартного раствора, мкг;
P - масса или объем анализируемой пробы, г или мл.
Требования безопасности. Необходимо
соблюдать правила безопасности при работе с органическими растворителями и
токсичными веществами.