"Методические указания по определению гранул вируса гранулеза яблонной плодожорки на растительных объектах иммунофлюоресцентным методом"

Утверждены

Минздравом СССР

30 марта 1981 г. N 2352-81

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГРАНУЛ ВИРУСА ГРАНУЛЕЗА ЯБЛОННОЙ ПЛОДОЖОРКИ

НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

Краткая характеристика препарата. Вирин-ГЯП - вирусный

энтомопатогенный препарат - вирусный инсектицид. Предназначается

для борьбы с гусеницами яблонной плодожорки в яблоневых садах.

Действующее начало препарата - вирус гранулеза семейства

бакуловирусов, находящийся в препарате в белковых

тельцах-включениях сферической формы (гранулах), образующихся в

клетках тканей больных вирозом гусениц. Размеры гранул 393,9 x

207,7 нм. Гранулы содержат одну, реже две вирусные частицы

(вирионы). Препарат - водная суспензия гранул с титром не менее

1 x 10 грн/мл. Применяется путем опрыскивания яблоневых деревьев

против гусениц всех возрастов.

Вирин-ГЯП не опасен для позвоночных животных с точки зрения

возможной инфекционности или токсичности при однократном или

множественном воздействии различных доз препарата. В связи с

низкой токсичностью ЛД не определяется. Пероральное введение

даже максимальных доз не приводит к гибели животных.

Принцип метода. Метод основан на специфической реакции взаимодействия антигена (гранулы) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем (ФИТЦ). Реакция выявляется при наблюдении в люминесцентный микроскоп в виде специфического ярко-зеленого свечения комплекса антиген - антитело ободка гранул.

При условии изготовления качественных иммунных антигранулезных сывороток иммунофлюоресцентный метод является экспресс-методом, высокочувствительным и специфичным.

Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно

2 11

определить от 1 x 10 до 1 x 10 гранул в 1 мл субстрата.

Реактивы и материалы. Ацетон. Хлорид натрия (pH 7,1 - 7,2), 0,85-процентный раствор. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Мертиолят. Меченная изотиоционатом флюоресцеина ослиная сыворотка против глобулинов кролика (изготовленная в Институте эпидемиологии и микробиологии им. И.Ф. Гамалеи). Специфическая антигранулезная кроличья сыворотка. Адъювант Фрейнда.

Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп. Окулярная сетка. Объект-микрометр. Центрифуга (до 12 тыс. об./мин.). Термостат (37 °C). pH-Метр. Колбы. Пробирки бактериологические. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки мерные и пастеровские.

Способ приготовления иммунных сывороток в лабораторных

условиях. В качестве инъекционного материала используют суспензию

очищенных гранул в растворе NaCl с титром не менее 1 x 10 грн/мл.

Гранулы извлекают из препарата вирин-ГЯП следующим образом.

Препарат диспергируют на магнитной мешалке в течение 20 мин. Затем

проводят дифференциальное центрифугирование при 1,5 тыс. об./мин.

для осаждения крупных частиц тканей гусениц 15 мин. Супернатант

отсасывают пипеткой, размешивают на магнитной мешалке и

центрифугируют при 2,5 тыс. об./мин. для осаждения микроорганизмов

10 мин. Осаждают гранулы центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в

течение 1 ч. Осадок гранул ресуспендируют в физиологическом

растворе и полученную суспензию обрабатывают антибиотиками из

расчета 500 - 1000 ед. пенициллина и стрептомицина на 1 мл взвеси.

Перед инъекцией взвесь гранул отмывают от антибиотиков центрифугированием при 12 тыс. об./мин. и ресуспендируют в стерильном 0,85-процентном растворе NaCl.

Одна из возможных схем иммунизации следующая: 3-кратное с интервалом в 3 дня подкожное обкалывание. При первой инъекции вводится 2 мл смеси антигена с адъювантом (1:1), при второй - 4 мл, при третьей - 6 мл смеси. Реиммунизация через 2 недели. Одна инъекция 6 мл смеси подкожно. Забор крови через неделю после реиммунизации. Сыворотку надо хранить с консервантом (мертиолят 1:10000) при температуре 20 °C либо лиофилизировать.

При отсутствии адъюванта и ограниченном количестве вируса можно рекомендовать следующий способ иммунизации: 2-кратное субконъюнктивальное введение с недельным интервалом. Реиммунизация через месяц. При каждой инъекции вводят по 0,5 мл суспензии гранул под конъюнктиву каждого глаза.

Подготовка к определению. Накануне исследования следует отъюстировать микроскоп, установить фильтры. Для подсчета гранул по форме, приводимой ниже, необходимо с помощью объект-микрометра определить сторону квадрата окулярной сетки, затем и ее площадь (S). При отсутствии окулярной сетки определяют с помощью объект-микрометра диаметр поля зрения и вычисляют площадь его по формуле:

S = пи r .

Отбор проб. Пробы с растительных объектов (листья, плоды) отбирают в стерильные бумажные пакеты.

Площадь поверхности плодов (яблок) определяют по формуле:

S = пи r .

Площадь поверхности листьев определяют следующим образом. Обводят на бумаге контур листа. По крайним точкам контура строят прямоугольник и измеряют его площадь. Затем определяют массу прямоугольника и массу вырезанного контура листа. Из полученной пропорции вычисляют площадь листа.

Из листьев делают нарезки и помещают их в колбу с подщелоченным 0,85-процентным раствором NaCl в соотношении 1:10. Колбу энергично встряхивают 10 - 15 мин., отстаивают 10 мин., надосадок центрифугируют 1 ч при 12000 об./мин., ресуспендируют в 1 мл воды.

Пробы с плодов можно брать методом смыва. Для этого пинцетом берут салфетку 5 x 5 см, смазывают в 0,85-процентном растворе NaCl (pH 7,4 - 7,6), избыток отжимают и тщательно протирают исследуемую площадь. Затем салфетку переносят в колбу с раствором NaCl (100 мл), энергично встряхивают 3 - 5 мин., салфетку отжимают пинцетом и удаляют. Полученные смывы фильтруют через 3 слоя марли для удаления грубых частиц, затем центрифугируют при 5 тыс. об./мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл дистиллированной воды.

Ход анализа. Аликвоту исследуемой суспензии 0,02 мл наносят на заранее размеченное предметное стекло площадью 4 кв. см. Высушивают на воздухе и фиксируют в ацетоне 10 мин. Для гашения неспецифического свечения препарат обрабатывают синькой Эванса, для чего используют ее водный раствор в разведении 1:10000. Время обработки не менее 10 мин. Препарат промывают в проточной воде, высушивают на воздухе. Препарат должен иметь слабо-голубую окраску. Затем на препарат наносят иммунную сыворотку против гранул яблонной плодожорки, предварительно разведенную 1:10 0,85-процентным раствором NaCl. Помещают в термостат во влажной камере (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне) при 37 °C. Через 20 мин. сыворотку смывают проточной водой, препарат подсушивают на воздухе, после чего наносят ослиную антикроличью меченную ФИТЦ сыворотку в рабочем разведении, указанном на ампуле. Выдерживают в термостате 20 мин. с последующим промыванием в проточной воде.

Подсушенный препарат готов к просмотру, который можно проводить в любом люминесцентном микроскопе, а также в обычном световом с применением опак-иллюминатора и люминесцентной установки ОИ-17, ОИ-18. Изложенный метод окраски позволяет выяснить даже единичные гранулы по их специфическому свечению. Ободок гранул имеет ярко-зеленое свечение на общем темном фоне препарата.

Контролем служат: препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической сыворотки; препараты, приготовленные из проб, взятых на необработанных участках.

Обработка результатов анализа. Число гранул на 1 кв. см исследуемой поверхности (M), определяют по формуле:

aSn

M = -----,

S VS

1 п

где:

a - среднее число гранул в одном квадрате окулярной сетки;

S - площадь мазка, кв. мм;

S - площадь квадрата окулярной сетки (площадь поля зрения),

кв. мм;

V - объем нанесенной на стекло суспензии, мл;

S - площадь исследуемой поверхности, кв. см;

n - разведение.

Гранулы подсчитывают не менее чем в 50 квадратах окулярной

сетки.

Пример. Для анализа взяли лист с обработанного препаратом

дерева. Определили площадь его поверхности: S = 70 кв. см x 2 =

140 кв. см (70 кв. см - площадь одной стороны листа). Сделали смыв

с листа и обработали описанным способом. Полученный препарат

покрасили. При просмотре препарата из смыва в люминесцентном

микроскопе подсчитали общее количество гранул в 50 квадратах

окулярной сетки (SUM = 335). Отсюда

SUM

50 335

a = ----- = --- = 6,7.

50 50

Площадь мазка S = 20 мм x 20 мм = 400 кв. мм. Площадь квадрата окулярной сетки определили с помощью объект-микрометра (S = 0,01 кв. мм). Объем нанесенной на стекло суспензии V = 0,02 мл. Разведение n = 1, т.к. полученный осадок гранул из смыва ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды.

6,7 x 400 4

M = ----------------- = 9,8 x 10 гранул на 1 кв. см.

0,01 x 0,02 x 140

Требования безопасности. При работе по определению остаточных количеств препарата вирин-ГЯП на растительных объектах соблюдаются общепринятые санитарно-гигиенические правила, рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы (условно-патогенные).