"Методические указания по определению БМК и бенлата по БМК в растительных объектах, вине, почве и воде методом тонкослойной хроматографии"

Утверждены

Минздравом СССР

31 августа 1973 г. N 1112-73

27 сентября 1978 г. N 1914-78

19 октября 1979 г. N 2067-79

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БМК И БЕНЛАТА ПО БМК В РАСТИТЕЛЬНЫХ

ОБЪЕКТАХ, ВИНЕ, ПОЧВЕ И ВОДЕ МЕТОДОМ

ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

--------------------------------

<*> Разработаны: К.Ф. Новиковой, Л.И. Лещинской (ВНИИХСЗР) [1]; Г.И. Крамаренко (ВИЛР); В.А. Сигаевой (Институт биофизики) [2]; Н.В. Бажановой, К.В. Аветисян (АрмНИИЗР) [3].

Краткая характеристика препарата. Бенлат (фундазол, беномил, Д-1991) -

системный фунгицид, рекомендуемый для борьбы с грибковыми болезнями

растений (парша, серая гниль и т.д.). Действующее начало препарата

N-(1-бутилкарбамидобензимидазолил-2)-O-метилкарбамат. Брутто-формула

C H NO . Молекулярная масса 290,0. В чистом виде - белые кристаллы, т. пл.

14 18 3

290 °C (с разложением). Практически нерастворим в воде, плохо растворим в

органических растворителях. В пищевых продуктах растительного происхождения

МДУ 0,5 мг/кг, в сахарной свекле, пшенице 1 мг/кг. В растениях, воде и

почве бенлат быстро гидролизуется до БМК.

БМК (бавестин, карбендазим, БАС-346) - системный фунгицид с аналогичной

бенлату областью применения. Действующее начало препарата - метиловый эфир

2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты. Брутто формула C H N O . Молекулярная

9 9 3 2

масса 191,3. В чистом виде - белые кристаллы, т. пл. выше 300 °C.

При 300 °C возгоняются с разложением, которое начинается при 230 °C.

Растворимость в 100 г растворителей при 20 °C, г: для воды - 0,01;

этилового спирта - 0,04; ацетона - 0,03; циклогексана - 0,001; бензола -

0,001; хлороформа - 0,01. В сахарной свекле МДУ 0,1 мг/кг. В огурцах,

яблоках, винограде, землянике, черной смородине содержание БМК не

допускается.

Принцип метода. Метод основан на извлечении бенлата и БМК из анализируемых объектов этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в соляную кислоту, а затем, после подщелачивания раствора, в этилацетат и определении БМК методом ТСХ.

Метрологическая характеристика метода. Предел обнаружения в хроматографируемой пробе: на УФ пластинках - 3 мкг [1]; 5 мкг при проявлении пластинки бромфеноловым реагентом [2]; 10 мкг при проявлении пластин фосфорно-молибденовой кислотой [3|. Предел определения в исследуемых объектах, мг/кг: арбузы, яблоки, огурцы - 0,1; семена хлопка, льна - 0,2; семена мака, шиповника, в подорожнике - 0,3; в почве - 0,15; воде - 0,02; в вине - 0,1 мг/л. Среднее значение определения стандартных количеств бенлата и БМК при n = 15 во всех объектах - 80,0%. Стандартное отклонение при n = 15 +/- 7,1%. Доверительный интервал среднего при p = 0,95 и n = 5 80 +/- 9%. Размах варьирования для всех объектов 70,0 - 90,0%.

Избирательность метода. Метод селективен. Цирам, цинеб, ТМТД, каптан и другие определению не мешают.

Реактивы и материалы. Ацетон х.ч. Хлороформ свежеперегнанный, х.ч.

Этилацетат свежеперегнанный, х.ч. Этиловый спирт, 96-процентный. Гексан

х.ч. Циклогексан х.ч. Аммиак, 30-процентный раствор. Гидроксид натрия 4 н.

Безводный сульфат натрия х.ч. Хлороводородная кислота, 0,1 н раствор.

Ледяная уксусная кислота. Фосфорно-молибденовая кислота ч.д.а.,

1-процентный раствор в этиловом спирте. Нитрат серебра ч.д.а.,

1-процентный. Бромфеноловый синий ч.д.а., 0,05-процентный раствор в

ацетоне. Проявляющий реагент: 1-процентный водный раствор азотнокислого

серебра и 0,05-процентный раствор бромфенолового синего смешать перед

употреблением (1:1). Лимонная кислота, 2,5-процентный раствор. Пластинки

"Силуфол" УФ . Стандартный раствор БМК в ацетоне с содержанием 100 и

254

10 мкг/мл. Раствор стабилен при хранении в холодильнике 6 мес.

Приборы, аппаратура, посуда. Аппарат для встряхивания. Ротационный вакуумный испаритель. Кофейная мельница. Почвенное сито. Лампа УФ-света типа "Хроматоскоп" или аналогичная с диапазоном излучения 250 - 260 нм. Воронки делительные на 500 и 1500 мл. Колбы: конические на 250 мл; круглодонные на 250 мл; грушевидные на 50 мл; плоскодонные на 500 мл; мерные на 100 мл. Мерные цилиндры. Центрифужные пробирки на 10 мл; градуированные с оттянутым кончиком; пипетки на 10; 5; 1 и 0,1 мл.

Подготовка к определению. Хроматографические камеры заполняют системами подвижных растворителей за 1 ч до начала хроматографирования для насыщения парами растворителей.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Образец из огурцов, яблок, арбузов с помощью ножа измельчают на кусочки размерами 0,5 x 0,5 x 0,5 см, отбирают среднюю пробу 30 г. Навеску пробы помещают в коническую колбу на 250 мл, заливают 100 мл этилацетата и экстрагируют фунгицид с помощью механического встряхивания в течение 30 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку на 500 мл. Экстракцию повторяют еще 2 раза этилацетатом порциями по 75 мл. Из объединенного экстракта БМК извлекают реэкстракцией 0,1 н HCl 3 раза по 50 мл. Объединенный солянокислый экстракт дважды промывают гексаном порциями по 30 мл. Гексановый слой отбрасывают. К солянокислому раствору добавляют 4 мл 4 н раствора едкого натра (до pH 10) и трижды экстрагируют БМК этилацетатом порциями по 50 мл. Этилацетатный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 200 мл и с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель.

Пробу из семян хлопка, льна, зерна [1] измельчают с помощью кофейной мельницы до размера частиц, равных размеру частиц манной крупы. Навеску в 15 г помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, заливают этилацетатом (100 мл), а затем проводят экстракцию БМК и очистку экстракта, как указано для огурцов.

Пробу вина (30 мл) помещают в делительную воронку на 300 мл и трижды экстрагируют БМК этилацетатом порциями по 50 мл. Дальнейшую очистку экстракта проводят по схеме, описанной для огурцов.

Пробу подорожника, семян мака, плодов шиповника [7] массой 10 г измельчают (кроме мака), заливают 100 мл этилацетата и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 1,5 ч. Добавляют безводный сульфат натрия и отфильтровывают через бумажный фильтр в делительную воронку. Промывают растительную пробу 2 раза этилацетатом порциями по 50 мл и отфильтровывают в ту же делительную воронку. Экстрагируют БМК трижды 0,1 н раствором соляной кислоты порциями по 50 мл. Объединенный солянокислый раствор 2 раза промывают петролейным эфиром (т. кип. 70 - 100 °C) порциями по 50 мл. К солянокислому раствору добавляют 4 н раствор едкого натра до pH 10. Далее поступают так, как описано для огурцов.

Просеянную через почвенное сито почву [1] растирают в ступке, отбирают навеску в 20 г, переносят ее в колбу на 500 мл, тщательно увлажняют водой (5 мл), а затем заливают 100 мл этилацетата и экстрагируют БМК с помощью механического встряхивания в течение 1 ч. Экстракцию повторяют еще 2 раза этилацетатом порциями по 50 мл. Каждую порцию экстракта фильтруют в делительную воронку, и дальнейшее определение проводят по схеме, описанной для огурцов.

Воду (1 л) помещают в делительную воронку на 1500 мл, добавляют около 30 г NaCl, затем по каплям - 4 н едкий натр до pH 10 и экстрагируют БМК этилацетатом порциями один раз по 100 мл и 2 раза по 50 мл [1]. Дальнейшую очистку объединенного экстракта проводят по схеме, описанной для огурцов.

Хроматографирование. Сухой остаток после удаления растворителя смывают

количественно с помощью 2 - 3 мл ацетона в пробирку с оттянутым кончиком. В

пробирку помещают заплавленный сверху стеклянный капилляр и упаривают

ацетон, нагревая пробирку на горячей водяной бане до объема около 0,1 мл.

Остаток с помощью того же капилляра, но с отломанным заплавленным концом,

наносят на хроматографическую пластинку. Параллельно на пластинку наносят

серию стандартных растворов БМК с содержанием 3; 4; 5; 6; ...; 10 мкг.

Хроматограмму развивают либо в системе этилацетат-хлороформ-ледяная

уксусная кислота (50:50:10), либо в системе толуол-этилацетат-этиловый

спирт-аммиак (60:10:20:2). БМК проявляется при облучении пластин под лампой

УФ-света в виде синих флюоресцирующих пятен на желтом фоне с R в первом

случае 0,37 +/- 0,02, во втором - 0,47 +/- 0,01. Для проб вина можно

использовать лишь вторую систему, так как в первой на уровне БМК

присутствуют пятна неизвестных коэкстрактивных веществ. Линейный диапазон

определения 3 - 10 мкг. Пятна стабильны несколько месяцев [1].

Экстракты подорожника, мака и шиповника [2] хроматографируют в системе

хлороформ-ацетон-циклогексан-уксусная кислота (7:1:2:1), R БМК в этой

системе 0,38 +/-0,02. Если хроматограмму развивали на пластинке "Силуфол"

без флюоресцентной добавки, то хроматограмму обрабатывают из пульверизатора

1-процентным спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты. После

выдерживания пластинки в течение 15 мин. под УФ-светом БМК проявляется в

виде желтовато-белых пятен на бледно-голубом фоне. Нижний предел

определения 10 мкг в пробе [3]. Линейный диапазон определения 10 - 20 мкг.

Хроматограмму на пластинке "Силуфол" без флюоресцентной добавки можно также

обрабатывать после нагревания в сушильном шкафу при температуре 100 °C в

течение 5 - 10 мин. смесью азотнокислого серебра с бромфеноловым синим и

после 2 - 5 мин. нагревания в сушильном шкафу снимают фон 2,5-процентным

раствором лимонной кислоты.

На хроматограммах БМК проявляется в виде синих пятен на лимонном фоне [2]. Линейный диапазон определения 5 - 10 мкг.

Обработка результатов анализа. Содержание БМК в пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:

X = -,

где:

A - количество БМК, найденное в хроматографируемой пробе методом соотношения со стандартами, мкг;

P - навеска или объем исследуемой пробы, г или мл.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать правила безопасности, рекомендуемые для работы с легковоспламеняющимися жидкостями.